ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പിലെ ഒരു പ്രധാന ഘടകമാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടർ.ഒരു സാധാരണ സിസ്റ്റത്തിന് മൂന്ന് അടിസ്ഥാന ഫിൽട്ടറുകളുണ്ട്: ഒരു എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടർ, ഒരു എമിഷൻ ഫിൽട്ടർ, ഒരു ഡൈക്രോയിക് മിറർ.അവ സാധാരണയായി ഒരു ക്യൂബിൽ പായ്ക്ക് ചെയ്യപ്പെടുന്നു, അങ്ങനെ ഗ്രൂപ്പ് മൈക്രോസ്കോപ്പിലേക്ക് ഒരുമിച്ച് ചേർക്കുന്നു.
ഒരു ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടർ എങ്ങനെയാണ് പ്രവർത്തിക്കുന്നത്?
ആവേശം ഫിൽട്ടർ
എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾ ഒരു പ്രത്യേക തരംഗദൈർഘ്യത്തിന്റെ പ്രകാശം പ്രക്ഷേപണം ചെയ്യുകയും മറ്റ് തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു.ഒരു നിറം മാത്രം അനുവദിക്കുന്നതിന് ഫിൽട്ടർ ട്യൂൺ ചെയ്ത് വ്യത്യസ്ത നിറങ്ങൾ നിർമ്മിക്കാൻ അവ ഉപയോഗിക്കാം.എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾ രണ്ട് പ്രധാന തരത്തിലാണ് വരുന്നത് - ലോംഗ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകളും ബാൻഡ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകളും.എക്സൈറ്റർ സാധാരണയായി ഒരു ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടറാണ്, അത് ഫ്ലൂറോഫോർ ആഗിരണം ചെയ്യുന്ന തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളെ മാത്രം കടത്തിവിടുന്നു, അങ്ങനെ ഫ്ലൂറസെൻസിന്റെ മറ്റ് സ്രോതസ്സുകളുടെ ആവേശം കുറയ്ക്കുകയും ഫ്ലൂറസെൻസ് എമിഷൻ ബാൻഡിലെ ഉത്തേജക പ്രകാശത്തെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു.ചിത്രത്തിലെ നീല വരയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ബിപി 460-495 ആണ്, അതായത് 460-495nm ഫ്ലൂറസെൻസിലൂടെ മാത്രമേ ഇത് കടന്നുപോകാൻ കഴിയൂ.
ഇത് ഒരു ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പിന്റെ പ്രകാശ പാതയ്ക്കുള്ളിൽ സ്ഥാപിക്കുകയും ഫ്ലൂറോഫോർ എക്സിറ്റേഷൻ ശ്രേണി ഒഴികെയുള്ള പ്രകാശ സ്രോതസ്സിന്റെ എല്ലാ തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളും ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.ഫിൽട്ടർ മിനിമം ട്രാൻസ്മിഷൻ ചിത്രങ്ങളുടെ തെളിച്ചവും തിളക്കവും നിർണ്ണയിക്കുന്നു.ഏത് എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറിനും കുറഞ്ഞത് 40% ട്രാൻസ്മിഷൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, അതായത് ട്രാൻസ്മിഷൻ അനുയോജ്യമായി > 85% ആണ്.എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറിന്റെ ബാൻഡ്‌വിഡ്ത്ത് പൂർണ്ണമായും ഫ്ലൂറോഫോർ എക്സിറ്റേഷൻ പരിധിക്കുള്ളിലായിരിക്കണം, അതായത് ഫിൽട്ടറിന്റെ മധ്യ തരംഗദൈർഘ്യം (സിഡബ്ല്യുഎൽ) ഫ്ലൂറോഫോറിന്റെ പീക്ക് എക്സിറ്റേഷൻ തരംഗദൈർഘ്യത്തോട് കഴിയുന്നത്ര അടുത്താണ്.എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടർ ഒപ്റ്റിക്കൽ ഡെൻസിറ്റി (OD) പശ്ചാത്തല ഇമേജ് ഡാർക്ക്നെസ് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു;ട്രാൻസ്മിഷൻ ശ്രേണി അല്ലെങ്കിൽ ബാൻഡ്‌വിഡ്‌ത്തിന് പുറത്തുള്ള തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളെ ഒരു ഫിൽട്ടർ എത്രത്തോളം തടയുന്നു എന്നതിന്റെ അളവാണ് OD.കുറഞ്ഞത് 3.0 OD ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, എന്നാൽ 6.0 അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ കൂടുതലുള്ള OD അനുയോജ്യമാണ്.
എമിഷൻ ഫിൽട്ടർ
എമിഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾ സാമ്പിളിൽ നിന്നുള്ള അഭികാമ്യമായ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഡിറ്റക്ടറിൽ എത്താൻ അനുവദിക്കുക എന്നതാണ്.അവ ചെറിയ തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളെ തടയുകയും ദൈർഘ്യമേറിയ തരംഗദൈർഘ്യത്തിന് ഉയർന്ന സംപ്രേക്ഷണം നടത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.ഫിൽട്ടർ തരം ഒരു സംഖ്യയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഉദാ: ചിത്രത്തിലെ BA510IF (ഇടപെടൽ ബാരിയർ ഫിൽട്ടർ), ആ പദവി അതിന്റെ പരമാവധി പ്രക്ഷേപണത്തിന്റെ 50% തരംഗദൈർഘ്യത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾക്കുള്ള അതേ ശുപാർശകൾ എമിഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾക്കും ബാധകമാണ്: മിനിമം ട്രാൻസ്മിഷൻ, ബാൻഡ്‌വിഡ്ത്ത്, OD, CWL.അനുയോജ്യമായ CWL, മിനിമം ട്രാൻസ്മിഷൻ, OD കോമ്പിനേഷൻ എന്നിവയുള്ള ഒരു എമിഷൻ ഫിൽട്ടർ സാധ്യമായ ഏറ്റവും തിളക്കമുള്ള ഇമേജുകൾ നൽകുന്നു, സാധ്യമായ ആഴത്തിലുള്ള തടയൽ, ഒപ്പം മങ്ങിയ എമിഷൻ സിഗ്നലുകൾ കണ്ടെത്തുന്നത് ഉറപ്പാക്കുന്നു.
ഡിക്രോയിക് മിറർ
എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറിനും എമിഷൻ ഫിൽട്ടറിനും ഇടയിൽ 45° കോണിൽ ഡൈക്രോയിക് മിറർ സ്ഥാപിക്കുകയും ഡിറ്റക്ടറിലേക്ക് എമിഷൻ സിഗ്നൽ കൈമാറുമ്പോൾ ഫ്ലൂറോഫോറിലേക്കുള്ള ആവേശ സിഗ്നലിനെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ഐഡിയൽ ഡൈക്രോയിക് ഫിൽട്ടറുകൾക്കും ബീം സ്പ്ലിറ്ററുകൾക്കും പരമാവധി പ്രതിഫലനത്തിനും പരമാവധി പ്രക്ഷേപണത്തിനും ഇടയിൽ മൂർച്ചയുള്ള സംക്രമണങ്ങളുണ്ട്, എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറിന്റെ ബാൻഡ്‌വിഡ്‌ത്തിന്> 95% പ്രതിഫലനവും എമിഷൻ ഫിൽട്ടറിന്റെ ബാൻഡ്‌വിഡ്‌ത്തിന്> 90% പ്രക്ഷേപണവും ഉണ്ട്.സ്‌ട്രേ-ലൈറ്റ് കുറയ്ക്കാനും ഫ്ലൂറസെന്റ് ഇമേജ് സിഗ്നൽ-ടു-നോയ്‌സ് അനുപാതം പരമാവധിയാക്കാനും ഫ്ലൂറോഫോറിന്റെ ഇന്റർസെക്ഷൻ തരംഗദൈർഘ്യം (λ) മനസ്സിൽ കരുതി ഫിൽട്ടർ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.
ഈ ചിത്രത്തിലെ ഡൈക്രോയിക് മിറർ DM505 ആണ്, ഈ മിററിന്റെ പരമാവധി പ്രക്ഷേപണത്തിന്റെ 50% തരംഗദൈർഘ്യം 505 നാനോമീറ്ററാണ് എന്നതിനാലാണ് ഈ പേര് നൽകിയിരിക്കുന്നത്.ഈ മിററിനുള്ള ട്രാൻസ്മിഷൻ കർവ് 505 nm-ന് മുകളിലുള്ള ഉയർന്ന സംപ്രേക്ഷണം കാണിക്കുന്നു, 505 നാനോമീറ്റർ ഇടത്തേക്കുള്ള പ്രക്ഷേപണത്തിൽ കുത്തനെയുള്ള ഇടിവ്, 505 നാനോമീറ്റർ ഇടത്തേക്ക് പരമാവധി പ്രതിഫലനക്ഷമത എന്നിവ കാണിക്കുന്നു, പക്ഷേ ഇപ്പോഴും 505 nm-ൽ താഴെയുള്ള ട്രാൻസ്മിഷൻ ഉണ്ടായിരിക്കാം.
ലോംഗ് പാസും ബാൻഡ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകളും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം എന്താണ്?
ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടറുകൾ രണ്ട് തരങ്ങളായി തിരിക്കാം: ലോംഗ് പാസ് (എൽപി), ബാൻഡ് പാസ് (ബിപി).
ലോംഗ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ ദൈർഘ്യമേറിയ തരംഗദൈർഘ്യങ്ങൾ പ്രക്ഷേപണം ചെയ്യുകയും ചെറിയവയെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു.കട്ട്-ഓൺ തരംഗദൈർഘ്യം പീക്ക് ട്രാൻസ്മിഷന്റെ 50% മൂല്യമാണ്, കൂടാതെ കട്ട്-ഓണിന് മുകളിലുള്ള എല്ലാ തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളും ലോംഗ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ വഴി കൈമാറുന്നു.ഡൈക്രോയിക് മിററുകളിലും എമിഷൻ ഫിൽട്ടറുകളിലും അവ പതിവായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ആപ്ലിക്കേഷന് പരമാവധി എമിഷൻ ശേഖരണം ആവശ്യമായി വരുമ്പോഴും സ്പെക്ട്രൽ വിവേചനം അഭികാമ്യമല്ലെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ ആവശ്യമില്ലാത്തപ്പോഴും ലോംഗ്പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ ഉപയോഗിക്കണം, താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ പശ്ചാത്തല ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസ് ഉള്ള മാതൃകകളിൽ ഒരൊറ്റ എമിറ്റിംഗ് സ്പീഷീസ് സൃഷ്ടിക്കുന്ന പേടകങ്ങളുടെ കാര്യമാണിത്.
ബാൻഡ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ ഒരു നിശ്ചിത തരംഗദൈർഘ്യ ബാൻഡ് മാത്രം പ്രക്ഷേപണം ചെയ്യുകയും മറ്റുള്ളവരെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു.ഫ്ലൂറോഫോർ എമിഷൻ സ്പെക്ട്രത്തിന്റെ ഏറ്റവും ശക്തമായ ഭാഗം മാത്രം സംപ്രേക്ഷണം ചെയ്യാൻ അനുവദിച്ചുകൊണ്ട് അവ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്ക് കുറയ്ക്കുന്നു, ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസ് ശബ്ദം കുറയ്ക്കുന്നു, അങ്ങനെ ലോംഗ് പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ നൽകാൻ കഴിയാത്ത ഉയർന്ന പശ്ചാത്തല ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസ് സാമ്പിളുകളിൽ സിഗ്നൽ-ടു-നോയ്‌സ് അനുപാതം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.
BestScope-ന് എത്ര തരം ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടർ സെറ്റുകൾ നൽകാൻ കഴിയും?
ചില സാധാരണ ഫിൽട്ടറുകളിൽ നീല, പച്ച, അൾട്രാവയലറ്റ് ഫിൽട്ടറുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു.പട്ടികയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ.
| ഫിൽട്ടർ സെറ്റ് | ആവേശം ഫിൽട്ടർ | ഡിക്രോയിക് മിറർ | ബാരിയർ ഫിൽട്ടർ | LED വിളക്ക് തരംഗദൈർഘ്യം | അപേക്ഷ |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | · FITC: ഫ്ലൂറസെന്റ് ആന്റിബോഡി രീതി ആസിഡിൻ ഓറഞ്ച്: ഡിഎൻഎ, ആർഎൻഎ · ഓറമിൻ: ട്യൂബർക്കിൾ ബാസിലസ് ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·റോഡമിൻ, TRITC: ഫ്ലൂറസന്റ് ആന്റിബോഡി രീതി പ്രൊപിഡിയം അയോഡൈഡ്: ഡിഎൻഎ ·ആർഎഫ്പി |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · ഓട്ടോ ഫ്ലൂറസെൻസ് നിരീക്ഷണം ·DAPI: ഡിഎൻഎ കളങ്കം ·Hoechest 332528, 33342: ക്രോമസോം സ്റ്റെയിനിംഗിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · കാറ്റെകോളമൈൻസ് · 5-ഹൈഡ്രോക്സി ട്രിപ്റ്റമിൻ ടെട്രാസൈക്ലിൻ: അസ്ഥികൂടം, പല്ലുകൾ |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | · Cy5 ·അലക്‌സാ ഫ്‌ളൂർ 633, അലക്‌സാ ഫ്‌ളൂർ 647 |
ഫ്ലൂറസെൻസ് ഏറ്റെടുക്കലുകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫിൽട്ടർ സെറ്റുകൾ ഫ്ലൂറസെൻസ് ആപ്ലിക്കേഷനുകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രധാന തരംഗദൈർഘ്യത്തെ ചുറ്റിപ്പറ്റിയാണ് രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്, ഇത് ഏറ്റവും കൂടുതൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫ്ലൂറോഫോറുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.ഇക്കാരണത്താൽ, DAPI (നീല), FITC (പച്ച) അല്ലെങ്കിൽ TRITC (ചുവപ്പ്) ഫിൽട്ടർ ക്യൂബുകൾ പോലെയുള്ള ഇമേജിംഗിനായി അവ ഉദ്ദേശിച്ചിട്ടുള്ള ഫ്ലൂറോഫോറിന്റെ പേരിലാണ് അവ അറിയപ്പെടുന്നത്.
| ഫിൽട്ടർ സെറ്റ് | ആവേശം ഫിൽട്ടർ | ഡിക്രോയിക് മിറർ | ബാരിയർ ഫിൽട്ടർ | LED വിളക്ക് തരംഗദൈർഘ്യം |
| എഫ്.ഐ.ടി.സി | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| ടെക്സസ് റെഡ് | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടർ എങ്ങനെ തിരഞ്ഞെടുക്കാം?
1. ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടർ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന്റെ തത്വം, ഫ്ലൂറസെൻസ്/എമിഷൻ ലൈറ്റ് ചിത്രീകരണത്തിലൂടെ കടന്നുപോകാൻ അനുവദിക്കുക, ഒപ്പം ഒരേ സമയം എക്സിറ്റേഷൻ ലൈറ്റിനെ പൂർണ്ണമായും തടയുക, അങ്ങനെ ഉയർന്ന സിഗ്നൽ-ടു-നോയ്‌സ് അനുപാതം ലഭിക്കും.പ്രത്യേകിച്ച് മൾട്ടിഫോട്ടൺ എക്‌സിറ്റേഷനും ടോട്ടൽ ഇന്റേണൽ റിഫ്‌ളക്ഷൻ മൈക്രോസ്‌കോപ്പും പ്രയോഗിക്കുന്നതിന്, ദുർബലമായ ശബ്ദം ഇമേജിംഗ് ഇഫക്‌റ്റിൽ വലിയ ഇടപെടൽ ഉണ്ടാക്കും, അതിനാൽ സിഗ്നൽ-നോയ്‌സ് അനുപാതത്തിന്റെ ആവശ്യകത കൂടുതലാണ്.
2. ഫ്ലൂറോഫോറിന്റെ ആവേശവും എമിഷൻ സ്പെക്ട്രവും അറിയുക.കറുത്ത പശ്ചാത്തലത്തിൽ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ളതും ഉയർന്ന ദൃശ്യതീവ്രതയുള്ളതുമായ ഇമേജ് സൃഷ്ടിക്കുന്ന ഒരു ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടർ നിർമ്മിക്കാൻ, എക്സിറ്റേഷൻ, എമിഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾ, ഫ്ലൂറോഫോർ എക്സിറ്റേഷൻ പീക്കുകൾ അല്ലെങ്കിൽ എമിഷൻ എന്നിവയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന പ്രദേശങ്ങളിൽ കുറഞ്ഞ പാസ്‌ബാൻഡ് റിപ്പിൾ ഉപയോഗിച്ച് ഉയർന്ന സംപ്രേഷണം നേടണം.
3. ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫിൽട്ടറുകളുടെ ദൈർഘ്യം പരിഗണിക്കുക.ഈ ഫിൽട്ടറുകൾ അൾട്രാവയലറ്റ് (UV) പ്രകാശം സൃഷ്ടിക്കുന്ന തീവ്രമായ പ്രകാശ സ്രോതസ്സുകളിലേക്ക് കടക്കാത്തതായിരിക്കണം, അത് "ബേൺഔട്ടിലേക്ക്" നയിച്ചേക്കാം, പ്രത്യേകിച്ച് എക്സൈറ്റർ ഫിൽട്ടർ പ്രകാശ സ്രോതസ്സിന്റെ പൂർണ്ണ തീവ്രതയ്ക്ക് വിധേയമാകുമ്പോൾ.
വ്യത്യസ്ത ഫ്ലൂറസെന്റ് സാമ്പിൾ ചിത്രങ്ങൾ
ഉറവിടങ്ങൾ ഇന്റർനെറ്റിൽ ശേഖരിക്കുകയും സംഘടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, അവ പഠനത്തിനും ആശയവിനിമയത്തിനും മാത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നു.എന്തെങ്കിലും ലംഘനമുണ്ടെങ്കിൽ, ഇല്ലാതാക്കാൻ ഞങ്ങളെ ബന്ധപ്പെടുക.
പോസ്റ്റ് സമയം: ഡിസംബർ-09-2022